1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法检测组织、蜂蜜、鸡蛋、尿样等样本中的金霉素药物（Chlorotetracycline ，CTC），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的金霉素药物和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗金霉素药物抗体，加入酶标记物后，用 TMB 底物显色，样本吸光度值与其所含金霉素药物含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中金霉素药物的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：37℃，30min～30min～15min

2.3 检测下限：

组织、肝脏、鸡蛋………………0.6ppb

蜂蜜………………………………4ppb

尿样………………………………1ppb

2.4 交叉反应率：

金霉素………………………………100%

四环素………………………………29%

土霉素………………………………15%

强力霉素……………………………2.5%

2.5 样本回收率：

组织（鸡、鸭、猪肉/肝、虾、鱼）…90±20%蜂蜜……………………………………75±20%

尿样……………………………………80±20%

3 试剂盒组成

酶标板……………………………96 孔

高浓度标准品溶液 1 瓶：（1ml/瓶）1.0ppm（高标准液有挥发性，需注意密封）

标准品溶液 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb（均为空瓶子，现配现用）。

酶标记物（红盖）…………………11ml

抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml

底物液 A（白盖）……………………6ml

底物液 B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

5×复溶液（黄盖）…………………50ml

说明书………………………………1 份

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量 0.01g）

4.2 微量移液器：单道 20μl-200μl，100μl-1000μl、多道 300μl

4.3 试剂：三*、甲醇

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液 1：1%三*溶液

称取 1g 三*加去离子水 100ml 溶解。

配液 2：复溶液

将5×复溶液用去离子水 5 倍稀释（1 份 5×复溶液加 4 份去离子水），用于样本的复溶，复溶液在 4℃环境可保存一个月。配液 3:工作洗涤液

将浓缩洗涤液 20 倍稀释(1 份洗涤液加 19 份去离子水)。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 组织（鸡、鸭、猪肉/肝、虾、鱼）、鸡蛋样本处理方法

1）用均质器均质组织、肝脏、鸡蛋样本；

2）称取 2±0.05g 样本于 50ml 离心管中，加入 6ml 1%三氯乙

酸溶液，振荡 2min，室温 4000r/min 以上，离心 10min；

3）取出 1ml 上清液于另一试管中，加入 1m 甲醇，振荡 1min，室温 4000r/min 以上，离心 10min；

4）取 1ml 上清液在 50-60℃氮气或空气吹干，加入 1ml 复溶液溶解残留的干燥物；

5）取 50 μl 用于分析。

样本稀释倍数：6 检测下限：0.6ppb 5.3.2 蜂蜜样本处理方法

1）准确称取 1±0.05g 蜂蜜样本于离心管中，加入 2ml 1%三*，振荡 2min，室温 4000r/min 以上，离心 10min；

2）取出 100ul 上清液于另一试管中，加入 1900ul 复溶液稀释，混合 30s；

3）取 50μl 用于分析。

样本稀释倍数：40 检测下限：4ppb

5.3.3 尿样本的处理方法

1）用复溶液将尿样 10 倍稀释（如果尿样浑浊一定要过滤或离

心10min，4000r/min，直至得到清亮尿样），暂不使用的样本应冷冻保存。

2）取 50μl 稀释的尿样用于分析。

样本稀释倍数：10 检测下限：1ppb

6 酶联免疫试验步骤

将所需试剂从 4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡 30min 以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。

实验开始前需配制标准品应用液；低浓度的标准品不稳定，需现配现用。

在0ppb 的瓶中加复溶液 3ml，0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、 2.7ppb 的瓶中分别加复溶液 2ml，8.1ppb 的瓶中加复溶液 3ml。

标准液 6：取 1.0ppm 高浓度标准品溶液 24.3ul 加入装有 3ml 复溶液 8.1ppb 的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为 8.1ppb。

标准液 5：取 1ml 标准液 6 加入装有 2ml 复溶液 2.7ppb 的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为 2.7ppb。

标准液 4：取 1ml 标准液 5 加入装有 2ml 复溶液 0.9ppb 的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为 0.9ppb。

标准液 3：取 1ml 标准液 4 加入装有 2ml 复溶液 0.3ppb 的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为 0.3ppb。

标准液 2：取 1ml 标准液 3 加入装有 2ml 复溶液 0.1ppb 的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为 0.1ppb。

标准液 1：直接使用复溶液，浓度即为 0ppb。

6.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品应用液或样本 50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液 50μl/孔，轻轻振荡 5 秒混匀，37℃避光反应 30 分钟。

6.3 洗 涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液 250μl/孔充分洗涤 5 次，每次间隔 30 秒，*用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 加酶反应：加酶标记物 100μl/孔，37℃避光反应 30 分钟。

6.5 洗 涤：同上

6.6 显 色：加底物液 A 50μl/孔，再加底物液 B 50μl/孔，轻轻振荡 5 秒混匀，37℃避光显色 15 分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。